流感病毒···痘苗病毒或天花病毒专利检索 抢救专利检索查询-专利检索网 (2023)

本发明涉及流感病毒疫苗生产领域。流感病毒（正粘病毒科）是具有分段基因组的包膜负链 RNA 病毒（Taubenberger 和 Layne，Molecular Diagnosis Vol. 6 No. 4 2001）。它们分为两个属：一个包括甲型和乙型流感，另一个由丙型流感组成，基于它们的核蛋白和基质蛋白之间的显着抗原差异。这三种病毒类型在致病性和基因组组织方面也不同。 A 型存在于多种温血动物中，但 B 型和 C 型主要是人类病原体。甲型流感病毒根据表面糖蛋白血凝素 (HA) 和 NA 的抗原特性进一步细分，它们从病毒体表面突出。目前有 15 种 HA 和 9 种 NA 亚型。甲型流感病毒感染多种动物，包括鸟类、猪、马、人类和其他哺乳动物。水禽是所有已知甲型流感亚型的天然宿主，很可能是人类大流行性流感毒株的遗传物质来源。

与相关的副粘病毒不同，流感病毒具有分段的 RNA 基因组。甲型流感病毒和乙型流感病毒的结构相似，而丙型流感病毒的结构则更为不同。 A 型和 B 型病毒各包含八个离散的基因片段，每个基因片段至少编码一种蛋白质，而 C 型病毒包含七个离散的片段，结合了 A 和 B 类型的片段 4 和 6。甲型和乙型流感病毒覆盖着三种蛋白质的投射物：HA、NA 和 Matrix 2 (M2)。丙型流感病毒只有一种表面糖蛋白。每个流感病毒 RNA 片段都被核蛋白 (NP) 包裹，形成核糖核苷酸核蛋白 (RNP) 复合物。三种聚合酶蛋白与 RNP 复合体的一端相连。 RNP 被膜包围，基质蛋白（基质 1）作为不可或缺的一部分。包膜的磷脂部分来自细胞宿主膜。在病毒颗粒中还发现了非结构蛋白 2 (NS2)。

世界卫生组织 (WHO) 的流感病毒命名指南如下。首先指出病毒类型（A、B 或 C），然后是宿主（如果不是人类）、隔离地点、隔离编号和隔离年份（以斜线分隔）。对于 A 型流感，HA 和 NA 亚型在括号中给出。例如，2000-2001 季最新的三价疫苗中包含的毒株是：A/Panama/2007/99 (H3N2)、A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 和 B/Yamanashi/16/98 .自 1977 年以来，甲型流感的两种亚型一直在人类中传播：H1N1 和 H3N2。

流感病毒在复制过程中会积累点突变，因为它们的 RNA 聚合酶复合物缺乏校对活性。改变表面糖蛋白抗原部分氨基酸的突变可以通过允许病毒株逃避预先存在的免疫力来赋予病毒株选择性优势。 HA 分子通过与特定宿主细胞上的受体结合来启动感染。针对 HA 蛋白的抗体可阻止受体结合，并且在防止再次感染相同菌株方面非常有效。 HA 可以通过抗原漂移逃避先前获得的免疫力，其中当前循环的 HA 基因中的突变破坏抗体结合，或通过抗原转变，其中病毒获得新亚型的 HA。整个 HA 分子的抗原漂移压力不相等，正向选择的变化主要发生在 HA 蛋白的球状头部。与 NA 相比，这些变化在 HA 中的累积程度也更高。其他流感蛋白的变化发生得更慢。同样，抗原漂移压力在适应人类的流感毒株中最大，在猪和马适应毒株中居中，而在禽流感毒株中最低。

由于流感病毒具有分段基因组，因此在同一宿主中同时感染两种不同毒株会导致产生新的、重排的流感毒株，这些毒株包含不同的亲代基因片段组合。已知有 15 种 HA 亚型存在于野生鸟类中，并且是人类新发现的 HA 的来源。通过人类循环中的抗原转变而出现的具有新亚型的流感病毒株是 1957 年和 1968 年最后两次流感大流行的原因，并且很可能是 1918 年流感大流行的原因。同意关于发生的一切已知大流行性流感病毒，大流行毒株的 HA 抗原必须不同于目前流行的 HA 抗原；这种 HA 不可能在人体内循环 60 到 70 年；并且病毒必须可以在人与人之间传播。在 1957 年和 1968 年，大流行都是由 HA 的转变引起的，在这两种情况下，大流行毒株的 HA 都与禽毒株密切相关。尽管大流行的绝对要求之一是 HA 必须改变，但尚不清楚病毒的其余部分可以或必须改变到什么程度。只有 1957 年和 1968 年的大流行病毒可用于直接研究，1918 年大流行流感病毒使用分子考古学进行表征。 1957 年，三个基因被类鸟类基因取代：HA、NA 和聚合酶复合物 (PB1) 的一个亚基。 1968 年仅更换了 HA 和 PB1。

流感感染的具体诊断可通过病毒分离、血凝抑制 (HI) 检测、免疫测定抗原检测、血清学检测、分泌物中 NA 活性检测或基于分子的检测来进行。标本可以通过用缓冲盐水溶液漱口收集为痰液、鼻咽拭子或鼻咽洗液。流感诊断的标准是培养的免疫学特征。血清学分析为流感感染提供了一种准确但可追溯的方法，因为它需要收集急性和恢复期血清。

流感病毒可以在含胚鸡蛋或各种组织培养系统中生长。添加胰蛋白酶（以激活 HA 的裂解）允许流感病毒在 Madin-Darby 犬肾细胞 (MDCK) 和其他细胞系中繁殖。疫苗生产的主要方法仍然是在鸡蛋中培养流感病毒。细胞系培养通常用于初步分离人流感病毒（A 型和 B 型）。许多人类流感病毒可以直接在含胚卵​​的尿囊腔中培养。一些甲型和乙型流感病毒需要在羊膜腔中进行初始培养，然后适应尿囊腔。培养分离后，大多数流感分离株可使用免疫测定或免疫荧光进行明确鉴定。流感病毒HA分子与气道细胞表面的唾液酸残基结合，使病毒得以进入。

可以通过利用流感病毒在体外凝集红细胞的能力来表征流感病毒株的抗原性。抗HA抗体可以抑制凝集。因此，血凝抑制 (HI) 测定是表征流感病毒株的标准方法之一。 HI 测定用于确定样品菌株是否与新疫苗菌株具有免疫相关性（即交叉反应）。通常在雪貂中制备的分型血清以一系列两倍稀释液添加到孔中，实验室工作人员对测试孔进行评分，寻找悬浮的红细胞和结块的红细胞。在大多数情况下，一组血清用于将样本菌株与疫苗和参考菌株进行匹配，并且在任何给定的流感季节，绝大多数样本菌株都通过 HI 检测成功匹配。 WHO 提供指导方针，WHO 合作中心提供指导方针，用于识别单个病毒株的抗原特征，并可以将这些毒株提供给希望接受它们的人。标本菌株根据免疫谱系分类，例如B. A/Moscow/10/99 (H3N2)-like、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-like 和 B/Beijing/184/93-like 病毒。对于未能通过 HI 测定表征的样品菌株，实验室工作人员必须将它们接种到雪貂中以产生菌株特异性抗血清。当新的抗血清准备就绪时，HI 测定将按所述再次运行。如果新血清在交叉反应性方面显示出显着差异（通常定义为样品株和疫苗株之间存在四倍差异），则将其纳入常规实验室检测组并用于筛选新的疾病株。因此，HI 测定在用于选择疫苗株的流感病毒监测中极为重要，并且是评估抗原漂移的最常用方法。

流感毒株可以通过每个基因片段的序列比较来进行遗传表征，WHO 指南和 WHO 合作中心再次为识别构成流感基因组的 RNA 片段的个体身份提供了指导；甲型和乙型流感病毒的核酸片段含有核蛋白（NP）、碱性聚合酶1（PB1）、碱性聚合酶2（PB2）、酸性聚合酶（PA）、血凝素（HA）、编码神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M1 和 M2）和非结构蛋白（NS1 和 NS2），以及编码核蛋白（NP）、碱性聚合酶 1（PB1）、碱性聚合酶 2（PB2）、血凝素神经氨酸酶样糖蛋白的丙型流感病毒核酸片段（ HN）、基质蛋白（M1 和 M2）和非结构蛋白（NS1 和 NS2）。

请求参考菌株，例如如需抗原分析、核酸序列比较和疫苗病毒鉴定，可发送至 WHO 流感参考和研究合作中心，45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia（传真：+61 3 9389 1881，网站: http //www.influenzacentre.org);世界卫生组织流感参考和研究合作中心，国立传染病研究所，Gakuen 4-7-1, Musashi-Murayama, Tokyo 208-0011, Japan（传真：+81 42 5610812 或 +81 42 5652498）；世界卫生组织流感监测、流行病学和控制合作中心，疾病控制和预防中心，1600 Clifton Road, G16 Mail stop G16, Atlanta, Georgia 30333, United States（传真：+1 404 639 23 34）；或 WHO 流感参考和研究合作中心，国家医学研究所，The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, England（传真：+44 208 906 4477）。更新的流行病学信息可在 WHO 网站 http://www.who.int/influenza 和 FluNet 地理信息系统 http://www.who.int/flunet 上获得 其预防的健康和经济效益正在增加，在过去十年中，疫苗接种和一些抗流感药物的使用和益处显着增加。许多国家的预期寿命延长意味着更多的人面临并发症的风险，流感流行期间医疗系统的压力得到更广泛的认可，更频繁的国际旅行为病毒传播创造了机会。同时，新产品的推出也拓宽了疾病预防和治疗的途径。大约 50 个国家/地区拥有政府资助的国家流感疫苗接种计划，并且许多其他国家/地区都可以使用该疫苗。疫苗接种的具体建议各不相同，但通常包括对高龄和 6 个月以上因既往慢性病而患重病风险增加的人群进行年度免疫。在某些国家/地区，该疫苗用于减少流感向医疗风险较高人群的传播。会员国需要在其总体公共卫生优先事项的背景下考虑流感预防措施的好处。

灭活疫苗根据其是否包含完整病毒颗粒、部分破坏的病毒颗粒（裂解疫苗）或纯化的包膜抗原（亚单位疫苗）分为不同类型。一些亚单位疫苗已与佐剂或递送系统结合。

一些国家已经批准了针对特定目标群体的减毒活流感疫苗。在俄罗斯联邦，一种疫苗的两种不同配方已用于健康成人和儿童，另一种活疫苗已经过广泛测试但尚未获得批准。在减毒活疫苗得到更广泛的应用之前，它们不被广泛推荐用于流感预防。

已经开发了两类抗病毒剂来预防和治疗流感。 M2 抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺仅限于治疗甲型流感病毒，据说还能有效预防感染。虽然这两种产品都会引起一些副作用，但显着的神经系统副作用在金刚烷胺中更为常见。诸如扎那米韦和奥司他韦的神经氨酸酶抑制剂最近已在许多国家被批准用于治疗 A 型和 B 型流感，据报道可有效预防。已在接受两类抗病毒药物治疗的患者中发现耐药突变体。虽然这目前不被认为是一个主要的公共卫生问题，但如果这些药物被大规模使用，情况可能会发生变化。

世卫组织与 82 个国家的 110 个国家流感中心和位于亚特兰大（美国）、伦敦（英国）、墨尔本（澳大利亚）和东京（日本）的 4 个世卫组织流感参考和研究合作中心合作开展全球国际监测规划.这些中心为具有流行潜力的新兴毒株提供预警系统。该系统很重要，因为如果流感疫苗不含当前流行的毒株，其效力就会降低。 WHO 发布了世界卫生组织发布的 Weekly Epidemiological Record（例如，2004 年第 9 期，第 79 期，第 88 页或 http://www.who.int/wer）中规定的疫苗成分建议，2 月发现用于北半球的疫苗和 9 月用于南半球的疫苗。由于赤道地区流感的季节性模式不太明显，流行病学方面的考虑将影响这些疫苗建议（2 月或 9 月）中的哪些适合赤道国家/地区使用。

合作中心对国家中心提交的流感分离株进行抗原和遗传分析。当观察到抗原变异的证据时，将其与流行病学数据进行比较，以评估变异的流行病学意义。代表性分离株将使用接种疫苗前后收集的人类血清组与目前的疫苗株进行比较，以评估目前的疫苗是否有望抵御这些病毒。在 WHO 年度疫苗建议发布后，将开发高生长菌株并作为参考病毒提供给制造商，以帮助生产用于疫苗生产的种子病毒。流感疫苗的安全性和有效性测试包括病毒灭活、微生物灭菌、用于破坏病毒的化学物质的测量以及推荐抗原浓度的确认。建议疫苗应符合 WHO 的要求，但是，国家监管机构应批准每个国家/地区使用的特定疫苗病毒。国家卫生当局负责就疫苗的使用提出建议。世界卫生组织还发布了预防流感病毒感染的建议。 （参见 WER No. 35, 2002, pp. 281-288。）流感疫苗已在含胚鸡蛋中生产超过 50 年，但最近已做出重大努力来开发用于疫苗生产的细胞培养系统。传统的含胚鸡蛋标准方法非常繁琐，并且有一些主要缺点：需要数百万个鸡蛋；在美国，每个季节有超过 1 亿个鸡蛋，鸡蛋必须单独接种和收获；需要通过一系列过滤和离心步骤进行广泛纯化，以确保它们不含蛋蛋白，从而最大限度地降低过敏风险。需要许多难以自动化和劳动密集型的生产步骤，更不用说耗时且容易受到污染。

因此，业界长期以来一直需要开发一种比现有疫苗生产技术更具优势的疫苗生产技术，即。 H。通过开发使用特殊细胞株的制造方案，这些细胞株可以支持流感病毒的生长，并适合在自动化生物反应器、生物载体或其他细胞培养系统中生长，以取代现有的疫苗生产方法。

通常建议将特征良好的连续细胞系（例如 VERO 细胞或其他灵长类动物来源的细胞）用于流感病毒疫苗生产。然而，如今监管机构回避使用灵长类动物细胞制造的供人类使用的疫苗。这些权威机构越来越多地建议所有源自灵长类动物细胞的产品（例如 Vero）都应该不含完整的细胞残留物，并且对这些细胞制成的产品中残留物质的数量表示持续关注，例如灵长类动物细胞 DNA。尽管世界卫生组织 (WHO) 目前接受病毒疫苗连续细胞系残留 DNA 的限度为每剂量 10 ng a case by case basis - 病毒疫苗的基础。

长期以来，由于缺乏有效的反向遗传系统，甲型流感病毒的基础研究一直受到阻碍。尽管最早的负链 RNA 病毒反向遗传学技术确实是针对甲型流感病毒开发的，但仅从重组 DNA 中拯救这种病毒直到最近才实现。

重组流感病毒是通过用一组八个质粒转染真核细胞产生的，每个质粒都具有由 RNA 聚合酶 I 转录的基因组病毒 RNA (vRNA) 片段，以及一组编码核蛋白 (NP) 和表达蛋白的另外四个质粒聚合酶产生蛋白质 PB1、PB2 和 PA。据报道，使用这 12 种质粒系统生产病毒的效率相对较低。

当另外五个编码血凝素 (HA)、神经氨酸酶 (NA)、基质蛋白 1 和 2（M1 和 M2）以及非结构蛋白 2 (NS2) 的质粒共表达时，上清液中的病毒滴度可以增加。这些 12 和 17 质粒系统的一个优雅修改是双向载体的实施，以将转染的质粒数量减少到八个。使用该系统，可以从同一质粒合成负链 vRNA 和正链 mRNA。

生产重组甲型流感病毒的能力促进了未来的流感病毒研究，但是，目前还没有找到实用的解决方案来生产通过反向遗传学技术获得的重组甲型流感病毒，并且在疫苗生产中具有足够高的滴度，因为大多数（如果不是全部）细胞系统都使用由于反向遗传学系统中涉及的聚合酶与最常用的细胞物种之间的不相容性，在疫苗生产中几乎不允许或不允许上述重组病毒的复制。

甲型流感病毒是一种负链RNA病毒。这意味着在一个复制周期中会产生三种类型的 RNA：负义 vRNA、正义 cRNA 和正义 mRNA。与病毒 RNA (vRNA) 不同，mRNA 被加帽且带有 poly(A) 尾。 mRNA 的 poly(A) 尾巴的第一个 A 残基与基因组中的一小段 U 残基相匹配，这被认为是转录终止/聚腺苷酸化信号。据信，当聚合酶到达这一段 U 残基时，它会经历向后滑动的重复循环，从而产生 mRNA 的整个 poly(A) 尾巴。

发明内容

本发明提供了一种流感病毒反向遗传学系统，可应用于多种物种的细胞类型。聚合酶 I 是一种转录核糖体 RNA 的核仁酶，在生长细胞中大量表达。 rRNA 与 vRNA 一样，未加帽且带有 poly(A) 尾，因此聚合酶 I 可用于从 cDNA 生成 vRNA。通过聚合酶 I 转录病毒 cDNA 可以生成具有正确 5' 和 3' 末端的病毒样 RNA。然而，虽然聚合酶 II 转录机制通常与来自不同物种的基因兼容，但聚合酶 I 转录表现出严格但不是绝对的物种特异性。这种物种特异性是由转录因子与启动子的相互作用赋予的，并且在较小程度上是由因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用赋予的。基于聚合酶 I 的反向遗传系统的物种特异性是疫苗开发的一个主要缺点，首先是因为聚合酶 I 启动子用于人类以外的细胞类型，例如人类。 B.犬或禽类聚合酶I启动子，其中未被描述。在行业中，定义明确的犬类（z. B. Madin Darby犬肾（MDCK））或禽类细胞（鸡胚成纤维细胞（CEF））用于用于生产流感病毒疫苗。

本发明提供了包含流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子的核酸或该核酸的互补链。与 Neumann & Kawaoka (Virology 287, 243-240, 2001) 的发现相反，他们指出与非分段病毒不同，T7 聚合酶被认为无功能的一个显着例外是流感病毒，其产生需要增加复杂性除了来自克隆的 cDNA 的聚合酶和核蛋白之外，本发明还合成了八种病毒 RNA，因此在用于这些基于噬菌体聚合酶的反向遗传学技术的质粒载体和包含它的元件方面，本发明提供了相当大的灵活性。例如，我们使用噬菌体 T7 RNA 聚合酶来产生 vRNA 或 cRNA 样 RNA 分子，但也可以使用其他各种 RNA 聚合酶，例如噬菌体 SP6 RNA 聚合酶。在优选的实施方案中，本发明提供了包含流感基因片段和T7启动子或核酸的互补链的核酸，使我们能够将本发明的系统应用于在流感病毒基因片段控制下的表达T7 启动子。在一个实施方案中，不存在聚合酶终止子。优选地，核酸除了启动子之外还具有一或两个额外的鸟嘌呤残基。提供根据本发明的核酸用于疫苗目的，其包含源自WHO推荐用于疫苗目的的流感病毒的基因片段。在优选的实施方案中，本发明提供了包含甲型流感病毒基因片段和T7启动子或该核酸的互补链的核酸。特别是在双向系统中，优选根据本发明的核酸不包含T7终止子。因为聚合酶优先从已与表达病毒的质粒共转染的质粒表达，所以本文提供的系统不限于任何特定物种。虽然基于T7聚合酶的反向遗传学系统有时被用于拯救非分段负链病毒，但基于噬菌体聚合酶技术的分段流感病毒反向遗传学系统从未被成功使用。有时试图通过在转录起始位点引入 G 残基以增强 T7 聚合酶驱动的转录来克服使用 T7 聚合酶转录 cDNA 的反向遗传学系统中的限制因素。这种方法被用于救援，例如然而，RV、VSV 和 SV，Zobel 等人。 (Virology. 1994 July; 202(1):477-9; Nucleic Acids Res. 1993 Aug. 11; 21(16):3607-14) 指出甲型流感基因片段的 5' 和 3' 必须必须精确定义病毒聚合酶才能正常发挥作用；因此，似乎没有在转录位点添加额外核苷酸的空间，并且反对在转录起始位点引入 G 残基。然而，令人惊讶的是，在本发明的一个优选实施方案中，我们提供了一种根据本发明的核酸，其具有至少一个与 T7 启动子相邻的额外鸟嘌呤残基，甚至优选地在与 T7 启动子相邻的位置提供两个额外的鸟嘌呤残基.本发明还提供了用 T7 聚合酶引发的 Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 或鸡胚成纤维细胞 (CEF)。特别地，本发明提供了具有至少一种根据本发明的核酸的细胞。本发明有助于使用多质粒系统，例如 17 质粒、或 12 质粒或 8 质粒系统，因为本发明提供了具有根据本发明另外提供的核酸的细胞 T7 聚合酶优选地从与一种或多种能够表达根据本发明的流感基因区段的质粒一起转染的质粒表达，该系统不限于特定物种。本文还提供使用根据本发明的细胞，其中T7聚合酶包含核定位信号。在一个优选的实施方案中，本文提供的细胞是非灵长类动物细胞，从而避免将衍生自根据本发明的核酸或细胞的灵长类动物DNA引入细胞材料或疫苗中。优选使用MDCK细胞或CEF细胞。本发明的一个优点是反向遗传学系统不需要辅助病毒，转染提供的所有病毒颗粒都包含所需的核酸，并且无需复杂的克隆过程即可用于后续的疫苗生产系统。本发明还首次提供了包含本发明核酸的可复制病毒颗粒。在美国专利。美国专利第 5,166,057 号没有提供这种具有复制能力的病毒颗粒，并且在本发明之前使用 T7 系统进行分段流感病毒的其他尝试也没有成功。病毒滴度为 ~10 的细胞培养组合物^4个在转染的细胞培养物中没有病毒复制的情况下，可以很容易地获得本文提供的病毒颗粒，可以将其扩增至 >10⁷如果允许病毒繁殖。在没有辅助病毒的情况下实现根据本发明的颗粒的复制是特别有用的。这种包含本发明的细胞或细胞衍生材料或本发明的病毒或病毒颗粒衍生材料的细胞培养组合物可以有利地用于制备药物组合物，所述药物组合物旨在产生针对流感感染对象的免疫保护病毒。当然，本文提供的此类电池并未在美国专利第 5,166,057 号。因此，本发明还提供了一种生产复制性流感病毒颗粒的方法，包括用至少一种根据本发明的核酸培养细胞。优选地，该方法中使用的至少一种核酸包含至少一个，但优选七个或八个流感基因区段和噬菌体聚合酶启动子或核酸的互补链。进一步优选该区段不包含噬菌体聚合酶终止子，这样的区段有利地在启动子旁边具有至少一个额外的鸟嘌呤残基或在启动子旁边具有两个额外的鸟嘌呤残基。优选地，这些片段源自WHO推荐用于疫苗用途的流感病毒，例如甲型流感基因片段。最后，本发明提供了可通过上述方法获得的复制性流感病毒颗粒。因此，本发明还提供了一种针对受试者感染流感病毒产生免疫保护的方法，包括向有此需要的受试者提供本文提供的组合物。此类组合物优选配制为疫苗，即。 H。通过将病毒颗粒或源自此类颗粒的病毒蛋白（亚单位疫苗）与合适的药物载体（例如盐水或佐剂（例如铝盐或其他常用赋形剂））混合。

人物传奇

飞哥。 1个用于基于 T7pol 的反向遗传学系统的构建体。有关克隆策略的详细信息，请参阅文本。

飞哥。 2个对用编码 GFP 微型基因组 (0.6 μg)、T7pol (0.6 μg) 和甲型流感病毒聚合酶基因（各 1 μg）的构建体转染的 293T 细胞进行 FACS 分析。左图：转染后 30 小时的 GFP 阳性细胞百分比。右图：GFP 阳性部分中的 GFP 表达水平（平均荧光）。在 x 轴上，转染的 GFP 微型基因组构建体以有义 (S) 或反义 (AS) 方向显示，并标明了额外 G 核苷酸的数量。黑条表示与甲型流感病毒聚合酶复合物的所有 4 种成分（PB2、PB1、PA 和 NP）共转染，白条表示对照转染，其中省略了 pHMG-NP 构建体。

飞哥。 3个293T 细胞的 FACS 分析转染了​​ 0.6 μg 带有 2 个额外 G 残基的反义 GFP 微型基因组、4 μg 甲型流感病毒聚合酶构建体和 0.6 μg 野生型 T7pol (C)，一种含有核定位信号的 T7pol (N)，或两者以 1:1 的比例 (C/N) 构建。左图：转染后 30 小时的 GFP 阳性细胞百分比。右图：GFP 阳性部分中的 GFP 表达水平（平均荧光）。

飞哥。 4个293T 或 BSR-T7 细胞的 FACS 分析转染了​​ 0.6 µg 编码具有 2 个额外 G 残基的反义 GFP 微型基因组的构建体和 4 µg 甲型流感病毒聚合酶构建体。显示了细胞的 GFP 阳性部分中的 GFP 表达水平（平均荧光）。用或不用表达含有核定位信号的 T7pol 的质粒转染细胞（293T 对 293T N 或 BSR-T7 对 BSR-T7 N）。黑条表示与甲型流感病毒聚合酶复合物的所有 4 种成分（PB2、PB1、PA 和 NP）共转染，白条表示对照转染，其中省略了 pHMG-NP 构建体。

飞哥。 5个293T 细胞的 FACS 分析转染了​​ 0.6 μg 编码具有 2 个额外 G 残基的反义 GFP 微型基因组 (AS-2G) 或有义 GFP 微型基因组 (S-0G) 和 0、6 μg 表达具有核定位信号的 T7pol 的质粒和 4 μg 表达甲型流感病毒聚合酶基因的质粒。左图：转染后 30 小时的 GFP 阳性细胞百分比。右图：GFP 阳性部分中的 GFP 表达水平（平均荧光）。黑条表示与甲型流感病毒聚合酶复合物的所有 4 种成分（PB2、PB1、PA 和 NP）共转染，白条表示对照转染，其中省略了 pHMG-NP 构建体。

飞哥。 6个293T 和 MDCK 细胞的 FACS 分析转染了​​ 0.6 μg 编码反义 GFP 微型基因组和 2 个额外 G 残基 (AS-2G) 的构建体、0.6 μg 编码具有表达核定位信号的 T7pol 的质粒和 4 μg 表达甲型流感病毒的质粒聚合酶基因。左图：转染后 30 小时的 GFP 阳性细胞百分比。右图：GFP 阳性部分中的 GFP 表达水平（平均荧光）。黑条表示与甲型流感病毒聚合酶复合物的所有 4 种成分（PB2、PB1、PA 和 NP）共转染，白条表示对照转染，其中省略了 pHMG-NP 构建体。

详细说明

示例 1

使用基于 T7 RNA 聚合酶的反向遗传学系统生成重组甲型流感病毒

介绍

长期以来，由于缺乏有效的反向遗传系统，甲型流感病毒的基础研究一直受到阻碍。尽管最早的负链 RNA 病毒反向遗传学技术确实是针对甲型流感病毒开发的 (7, 18)，但仅从重组 DNA 中拯救这种病毒直到最近才实现 (9, 20)。

甲型流感病毒是一种负链RNA病毒。在病毒复制周期中，会产生三种类型的 RNA：负义基因组病毒 RNA (vRNA)、与基因组 RNA 互补的正义 RNA (cRNA) 和正义信使 RNA (mRNA)。虽然 vRNA 和 cRNA 包含基本上未修饰的末端，但 mRNA 被加帽并具有 poly(A) 尾巴 (16)。

RNA 聚合酶 I (PolI) 是一种核仁酶，可转录核糖体 RNA (rRNA)，并在生长细胞中大量表达。与 vRNA 一样，rRNA 是未加帽的并且带有 poly(A) 尾 (23)。 Hobom 及其同事 (19, 21, 29) 使用 Pol I 成功地产生了具有精确 5' 和 3' 末端的人工流感病毒 vRNA 样片段。转录与 Pol I 启动子-终止子相关的 cDNA像具有正确 5' 和 3' 末端的分子 (29)。随后涉及辅助流感病毒的研究表明，这些基因组 vRNA 分子可以被流感病毒聚合酶复合物识别和复制，并被包装到流感病毒后代中。该系统允许产生在一个病毒基因片段或另一个基因片段中包含突变的流感病毒，从而允许研究病毒基因及其产物。由于使用辅助病毒，需要选择转染体病毒，非常麻烦。

纽曼等人。设计了一个 PolI 系统来完全从克隆的 cDNA 中恢复甲型流感病毒 (20)。编码全长甲型流感病毒 vRNA 的 cDNA 克隆在人 PolI 启动子和小鼠 PolI 终止子之间。原则上，将这八种质粒转染到真核细胞中应该导致所有八种流感病毒 vRNA 的合成。人胚胎肾细胞 (293T) 与这八种 vRNA 表达质粒和表达病毒核蛋白和聚合酶蛋白 PB2、PB1 和来自 RNA 聚合酶 II (PolII) 启动子的 PA 的质粒共转染。细胞 PolI 合成的 vRNA 被包装成 RNP，数量大于 1×10^3个回收每 ml (pfu/ml) 上清液的感染性病毒噬菌斑形成单位。与表达剩余病毒结构蛋白的质粒共转染导致病毒产量显着增加，即 3 × 10^4个二 5×10⁷pfu/毫升 (20)。福多等人。报道了用于恢复甲型流感病毒的类似系统 (9)。该系统依赖于八个质粒，所有质粒均编码八个 vRNA cDNA，侧翼为人 PolI 启动子，但包含肝炎 δ 病毒核酶序列 (HδVrib) 而不是 PolI 终止子序列。这些质粒与四种表达来自腺病毒 2 型主要晚期启动子的 PB1、PB2、PA 和 NP 蛋白的质粒共转染到 Vero 细胞中。使用等量的每种表达质粒，Fodor 等人。据报道，每 10 个中有 1 到 2 个传染性病毒颗粒的拯救率^6个转染细胞 (9)。我们开发了一个类似的反向遗传系统来生产重组流感病毒 A/PR/8/34。我们得出结论，病毒滴度为 ~10^4个在转染的细胞培养物中可以维持无病毒复制，可以提高到 >10⁷如果允许病毒复制 (4)。因为这些 PolI 驱动的系统需要共转染 12-16 个质粒，所以使用可以高效转染的细胞系对于重组病毒的高效生产是必要的。

随后，霍夫曼等人。开发了一种 PolI-PolII 双向转录系统，仅从八个质粒生成甲型流感病毒 (12)。在这个双向系统中，vRNA cDNA 被插入到人 PolI 启动子和最小小鼠 PolI 终止子序列之间。将整个盒插入 Pol 启动子和聚腺苷酸化位点之间。这允许从单个构建体分别从 PolI 和 PolII 启动子转录 vRNA 和 mRNA。将八个 PolI-PolII 质粒（每个编码一个甲型流感病毒基因片段）共转染到与 Madin Darby 犬肾 (MDCK) 细胞共培养的 293T 细胞中，导致感染性甲型流感病毒的恢复，产量高达2 × 10⁷pfu/ml 上清液 (12)。使用一个模板合成 mRNA 和 vRNA 减少了病毒生成所需的质粒数量。据报道，该系统的病毒生成效率与单向（12-16 质粒）PolI 系统相似。

虽然 PolII 启动子通常与不同物种的转录机制兼容，但 PolI 启动子的转录表现出严格的，但不是绝对的物种特异性。这种物种特异性是由转录因子与启动子的相互作用赋予的，并且在较小程度上是由这些因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用赋予的 (23)。

基于 PolI 的反向遗传系统的物种特异性构成了一个主要的缺点。上述反向遗传系统使用人 PolI 启动子，从而将重组病毒的生产限制在灵长类来源的细胞，例如 293T 细胞或 Vero 细胞。虽然 PolI 启动子已针对多个物种进行了表征，包括人类、小鼠、大鼠和猪 (8, 14, 17)，但对于许多其他物种，它们仍然未知。犬和​​禽细胞通常用于甲型流感病毒研究和疫苗生产，但犬和禽 PolI 启动子的特征尚未确定。为了提高流感病毒反向遗传学技术的灵活性，我们想开发一个通用的反向遗传学系统。我们选择设计一个基于甲型流感病毒基因片段在噬菌体 T7 RNA 聚合酶 (pT7) 启动子控制下的表达的系统。由于噬菌体 T7 RNA 聚合酶 (T7pol) 可以通过转染或使用稳定修饰的细胞系递送至细胞，因此该系统不限于任何特定物种的细胞。

基于 T7pol 的反向遗传学系统用于拯救非分段负链病毒。施奈尔等人。是第一个仅从克隆的 cDNA 中拯救非分段负链病毒的人 (27)。制备了编码狂犬病病毒 (RV) 的全长反基因组 RNA 的 cDNA 克隆。该 cDNA 的两侧是 pT7 和 HδVrib 序列以及 T7pol 终止子序列 (tT7)。在 T7pol 转录后，基因组的精确 3' 末端通过 3' 末端的 HδVrib 序列的自裂解产生。在 pT7 的控制下，将该质粒与编码病毒 N 蛋白和聚合酶蛋白 L 和 P 的表达质粒共转染到表达 T7pol 的细胞中。该程序挽救了重组 RV，但 2 × 10 中只有大约 1 例⁷转染细胞 (27)。从那时起，类似的系统被描述为副粘病毒科、弹状病毒科和丝状病毒科非分段 NSI 家族 (10)。

为了成功地从 cDNA 中恢复未分段的负链病毒，通常会产生正义反基因组 RNA (cRNA) 而不是负义 vRNA。裸露的阴性 vRNA 和编码病毒蛋白的阳性 mRNA 的共存被认为会导致杂交，从而阻止基因组组装成核糖核蛋白复合物 (RNP) (27)。负链病毒通常不会遇到这个问题，因为它们始终将基因组保持为 RNP 形式，从而防止杂交。仙台病毒 (15)、人副流感病毒 3 型 (6) 和人偏肺病毒 (11) 的回收已用编码负义基因组 RNA 的 cDNA 进行了报道；然而，效率明显低于正义 RNA 的结果。这一原理也适用于重组流感病毒的拯救。霍夫曼等人。 (13) 还确定了从正义反基因组 RNA 生产重组流感病毒的效率。与仅在细胞质中复制的非分段和分段负链病毒相比，甲型流感病毒可以以相似的效率从基因组和反基因组载体中拯救出来。

使用 pT7 的病毒拯救系统的一个限制因素是位置 +1 到 +3 的残基会影响转录。已经观察到，可以通过在 pT7 的下游引入 2 或 3 个 G 残基来增加 cDNA 的转录 (22)。这一观察结果已被用于挽救，例如，重组 RV (27)、水泡性口炎病毒 (28)、呼吸道合胞病毒 (3) 和人偏肺病毒 (11)。显然，在这些病毒中，基因组末端之一的额外 G 残基不影响病毒复制，但对 T7pol 驱动的转录有积极影响。

基于 T7pol 的系统已广泛用于流感病毒反向遗传学研究 (18)，但以前没有描述过基于质粒的重组流感病毒生产。在这里，我们首次描述了这种用于生产重组流感病毒的基于 T7pol 的反向遗传学系统。

材料和方法

细胞和病毒

Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞在补充有 10% FCS、100 IU/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、2 mM 谷氨酰胺、1.5 mg/ml 碳酸氢钠、10 mM Hepes 和非- 必需氨基酸。 293T 细胞在补充有 10% FCS、100 IU/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和非必需氨基酸的 DMEM (BioWhittaker) 中培养。 BSR-T7 细胞，一种稳定表达 T7 RNA 聚合酶的幼仓鼠肾细胞系 (2)。 BSR-T7 细胞在补充有 10% FCS、100 IU/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和 0.5 mg/ml G418（Life Technologies，Breda，The Netherlands）的 DMEM 中生长添加。 A/PR/8/34 流感病毒适用于在含胚鸡蛋中复制，但在哺乳动物细胞培养中可能无法最佳复制，在 Episerf 培养基（Gibco BRL）中培养的 MDCK 细胞中以低感染复数生长七次). 用 10 IU/ml 青霉素和 10 μg/ml 链霉素传代。第七次传代后病毒滴度为10^8个TCID₅₀/ml 是常规获得的。

293T细胞的转染

293T 细胞的瞬时磷酸钙介导转染基本上如所述 (24) 进行。在转染前一天将细胞接种在直径为 100 毫米的糊化培养皿中，以获得 50% 汇合的单层细胞。过夜转染后，转染培养基被替换为补充有 2% FCS 用于病毒生产或 10% FCS 用于所有其他转染的新鲜培养基。将细胞孵育 30 至 72 小时，之后收集上清液，必要时分析细胞的荧光。在所有实验中平行转染质粒 pEGFP-N1（Clontech，BD Biosciences，阿姆斯特丹，荷兰），并在 FACSCalibur（Becton Dickinson）流式细胞仪中测量荧光细胞的百分比，确认转染效率在范围内95-100 百分之百。通过在 300 x g 下离心 10 分钟澄清含有病毒的上清液。直接或在 4°C 下储存不到一周或在 -80°C 下储存超过一周后，测定上清液中的病毒滴度。

MDCK细胞的转染

基本上如前所述 (1) 进行 MDCK 细胞的瞬时转染。简而言之，将 240 µl Optimem I 培养基 (GibcoBRL) 添加到 10 µl Lipofectamine 2000 中，并在室温下孵育 5 分钟。向该混合物中加入预期量的 DNA，使用 Optimem I 培养基调整至 50 µl 的体积。该混合物在室温下孵育 20 分钟。孵育后，加入 200 μl 不含青霉素和链霉素的 MDCK 培养基（见上文），并将该混合物加入 1×10^6个悬浮在 6 孔板中的 MDCK 细胞。孵育5小时后，用PBS洗涤细胞两次并在2ml不含青霉素和链霉素的MDCK培养基中培养。孵育过夜后，将该培养基更换为含有 2% FCS 的 MDCK 培养基。

BSR-T7细胞的转染

对于 BSR-T7 细胞的瞬时转染，在转染前一天将 400,000 个细胞接种在 6 孔培养皿中以获得 50-70% 汇合的单层细胞。将无血清 DMEM (240 µl) 添加到 10 µl Lipofectamine 2000 中，并在室温下孵育 4 分钟。向该混合物中加入用无血清 DMEM 调节至 50 μl 的 DNA，并在室温下孵育 20 分钟。转染前，将培养基更换为 2 ml 无血清 DMEM。孵育后，将转染混合物滴加到细胞中并在37℃孵育5小时。转染后，细胞用 PBS 洗涤一次，并添加 2 ml DMEM，其中补充有 2% FCS 用于病毒生产或 10% FCS 用于 FACS 分析。

质粒

使用编码 T7pol 的真核表达载体（pAR3126 和 pAR3132）。质粒 pAR3126 编码野生型 T7pol，而质粒 pAR3132 表达含有核定位信号 (NLS) 的 T7pol，该信号可有效地将 T7pol 靶向细胞核 (5)。使用小鼠羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶启动子、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA 和 pHMG-NP 表达甲型流感病毒聚合酶蛋白的真核表达质粒 (25)。

来自 pPolI-CAT-RT (25) 的 HδVrib 通过 PCR 扩增并克隆到 pSP72 的 XbaI-BamHI 位点。将用 BamHI-EcoRV 消化的 tT7 序列克隆到 pSP72-HδVrib 的 BamHI-HpaI 位点，产生 pSP72-HδVrib-tT7 (MS24)。在引入的 BbsI 位点的适当背景下，将编码 pT7 的寡核苷酸连接到 pSP72-HδVrib-tT7 的 NdeI-XbaI 位点，产生载体 pSP72-pT7-HδVrib-tT7（MS25，飞哥。 1个).使用 pSP-Hu-GFP-Mu 克隆 (4)，将侧翼为流感病毒 A/PR/8/34 片段 5 NCR 的绿色荧光蛋白 (GFP) 开放阅读框插入 pSP72-pT7-HδVrib-tT7 的 BbsI 位点作为模板。这个 GFP 微型基因组在有义和反义方向上被克隆，并且在 pT7 的下游包含 0/2/3 个额外的 G 残基（飞哥。 1个).

为了将流感病毒 A/PR/8/34 的基因片段克隆到 pSP72-pT7-HδVrib-tT7 中，de Wit 等人。 (4)用作PCR模板(第4个3'核苷酸对应于国家流感序列数据库中报道的流感病毒A/PR/8/34的序列)。含有 AarI 限制性位点的引物用于克隆片段 1、2、3、4、6、7、8，平端连接用于片段 5；基因片段以反义方向克隆到 BbsI 位点，在 pT7 后含有 2 个额外的 G 残基。

双向载体 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV (MS65,飞哥。 1个) 是通过克隆 tT7 下游的 CMV 启动子 (PCMV) 来制作的，以允许从适当的基因片段中产生 mRNA。使用含有 AseI 限制位点的引物通过 PCR 扩增 pCMV。 pSP72-pT7-HδVrib-tT7 用 AseI 部分消化，pCMV 以适当的方向连接到 tT7 的下游以从基因片段产生 mRNA。

同样，克隆流感病毒 A/PR/8/34 片段以获得每个双向 T7pol 驱动的流感病毒 A/PR/8/34 构建体。

我们还生成了一组双向向量，其中删除了 tT7。这是通过用 BamHI-BpeEI 消化 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV，用 Klenow 酶处理并降级产生 pSP72-pT7-HδVrib-pCMV (MS90,飞哥。 1个).同样，克隆流感病毒 A/PR/8/34 片段以获得每个双向 T7pol 驱动的流感病毒 A/PR/8/34 构建体。

根据制造商的说明，使用 Big Dye Terminator v3.1 循环测序试剂盒（Applied Biosystems）和 3100 遗传分析仪（Applied Biosystems）对所有质粒进行测序。

使用基于 T7pol 的系统生产重组病毒

如上所述，用 5 μg 每种含有 PR/8/34 基因片段的单向质粒、5 μg 表达质粒 HMG-PB2、HMG-PB1、HMG-PA、HMG-NP 处理 293 个 T 细胞，分别和 15 µg pAR3132。或者，我们转染了 5 µg 的每个双向质粒，其中包含来自 PR/8/34 的基因片段和 15 µg 的 pAR3132。转染后 72 小时收集上清液，1 ml 用于感染融合的单层 MDCK 细胞。

病毒感染和滴定

接种前，MDCK 细胞用 PBS 洗涤两次，1 ml 293T 上清液用于在 6 孔板中接种融合的单层 MDCK 细胞；在感染期间，添加了 40 µg 胰蛋白酶（2.5%，Bio Whittaker）。将板在 37°C 下储存 1 小时并用 PBS 洗涤两次，然后用 2 ml EMEM (BioWhittaker) 补充 4% BSA、100 IU/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、2 mM 谷氨酰胺、1 5 mg添加 /ml 碳酸氢钠、10 mM Hepes、非必需氨基酸和 20 µg/ml 胰蛋白酶（感染培养基）。感染后 3 天收获培养物上清液，并测定 HA 活性作为细胞感染的指标。如前所述进行病毒滴定 (26)。简而言之，在感染培养基中对转染细胞上清液进行 10 倍连续稀释。接种前，细胞用 PBS 洗涤两次。 100 µl 稀释的培养物上清液用于在 96 孔板中接种融合的单层 MDCK 细胞。在 37°C 下 1 小时后，再次用 PBS 洗涤细胞，并向每个孔中加入 200 μl 新鲜感染培养基。感染后 3 天，测定培养物上清液的 HA 活性，作为单个孔中细胞感染的指标。使用 Spearman-Karber (26) 的方法从 10 次重复计算感染滴度。

结果

使用基于单向 T7pol 的反向遗传学系统进行 GFP 微型基因组分析 构建了包含 pT7、HδVrib 和 tT7 的单向载体。在有义 (S) 和反义 (AS) 方向克隆的 pSP72-pT7-HδVrib-tT7 中鉴定了一个开放的 GFP 阅读框，两侧是流感病毒 A/PR/8/34 第 5 段的非编码区 (NCR) 0、2 或 3 个额外的 G 残基 (飞哥。 1个和附录 2 和 3）。这些构建体分别命名为 S-0G、S-2G、S-3G、AS-0G、AS-2G 和 AS-3G。我们测试了其中哪些选项表现最好。

我们用 GFP 微型基因组之一（S-0G、S-2G、S-3G、AS-0G、AS-2G、AS-3G）、T7pol 表达质粒 (pAR3132) 和表达 Express PB2 的四种质粒转染 293T 细胞、PB1、PA 和 NP 蛋白（pHMG-PB2、pHMG-PB1、pHMG-PA、pHMG-NP）。作为对照，我们进行了相同的转染，但省略了 pHMG-NP，这会导致 GFP 微型基因组缺乏复制。转染后 30 小时，在 FACSCalibur 中分析细胞的荧光。

结果显示在飞哥。 2个.从左图中可以看出，在以反义方向转染带有两个额外 G 残基的 GFP 微型基因组后，观察到的 GFP 阳性细胞比例最高。

其他 GFP 微型基因组构建体也产生了一定比例的 GFP 阳性细胞，但略小。当比较 GFP 阳性细胞的平均荧光时 (飞哥。 2个, 右图), GFP 微型基因组再次在反义方向上表现最好, 有两个额外的 G 残基。在这个实验中，GFP 微型基因组在有义方向上表现最差，有两个额外的 G 残基，其他结构居中。

虽然我们在不同的 GFP-minigenome 质粒之间观察到表达 GFP 的细胞比例和 GFP 表达水平的一些变化（数据未显示），但 GFP minigenome 通常表现出反义方向，两个额外的 G 残基表现最好，因此选择该构造用于后续实验。

核与细胞质 T7pol 表达

我们可能必须解决的一个问题是 T7pol 的表达。对于副粘病毒反向遗传学，使用主要在细胞的细胞质中表达的 T7pol，这是可取的，因为副粘病毒复制也发生在细胞质中。流感病毒在细胞核中复制，因此在细胞质中表达 T7pol 可能不是最佳选择。因此，我们想比较使用细胞质版本的 T7pol（质粒 AR3126）或含有核定位信号的 T7pol（NLS，质粒 pAR3132）时的 GFP 表达水平。

该实验的结果示于图飞哥。 3个.当使用野生型 T7pol 表达质粒时，阳性细胞中的平均 GFP 荧光为 521。使用含有核定位信号的 T7pol 可以显着提高 GFP 表达水平（平均荧光 1106）。当两个 T7pol 构建体结合和不结合核定位信号（比率 1:1，转染质粒的总量保持不变）时，观察到中等水平的 GFP 表达（平均荧光 775）。在使用各种 GFP 微型基因组质粒的大量独立实验中，这些结果是可重复的；当使用核版本的 T7pol 时，观察到 GFP 表达增加 2 到 10 倍（数据未显示）。因此，在随后的实验中，我们使用了包含核定位信号的 T7pol。

瞬态与稳定的 T7pol 表达

对于几种副粘病毒反向遗传系统，T7pol 不是通过质粒转染提供的，而是通过使用允许稳定表达 T7pol 的细胞系提供的。幼仓鼠肾细胞 (BSR-T7) 可用于此。我们测试了 BSR-T7 细胞是否可用于流感病毒 GFP 微型基因组的转录，随后可以通过流感病毒聚合酶复合物进行复制，从而导致 GFP 表达（飞哥。 4个).

可以看出飞哥。 4个293T 细胞中的高 GFP 荧光强烈依赖于 T7pol 表达。在 BSR-T7 细胞中，GFP 微型基因组与流感病毒聚合酶复合物共转染后观察到相对高水平的 GFP 表达，这与省略 pHMG-NP 质粒的转染形成对比。当添加表达 T7pol 核心版本的质粒时，发现 GFP 表达更高。 BSR-T7 细胞中相对高水平的 GFP 表达表明 T7pol 的稳定表达比通过转染的瞬时表达更有效。然而，通过转染提供核 T7pol 的实验表明，对于流感病毒反向遗传学，表达核 T7pol 而不是野生型 T7pol 的稳定细胞系甚至更有效。

使用基于单向 T7pol 的反向遗传学系统生产重组病毒

接下来，将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆到载体pSP72-pT7-HδVrib-tT7中，用于产生重组流感病毒A/PR/8/34。

我们用编码流感病毒 A/PR/8/34、pT7pol (pAR3132)、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA 和 pHMG-NP 基因片段的八个构建体转染 293T 细胞。转染后，将胰蛋白酶添加到培养基中以允许产生的病毒复制。转染后 72 小时收集上清液并用于接种 MDCK 细胞。接种后 3 天，对这些 MDCK 细胞的上清液进行 HA 测定，作为病毒复制的指示。 HA 测试呈阳性。然后测定 293T 和 MDCK 上清液的病毒滴度。 293T 上清液中的病毒滴度显示为 1.6 x 10^1个TCID₅₀/毫升； MDCK 上清液中的病毒滴度为 2.0 × 10⁷TCID₅₀/ 毫升。当转染后未向 293T 细胞中添加胰蛋白酶时，293T 细胞和 MDCK 细胞中的病毒滴度略低（数据未显示）。因此，这代表了第一个仅由质粒组成且不使用 PolI 启动子的重组甲型流感病毒拯救。

双向 T7 系统

接下来，我们想开发一个受 pT7 控制的双向反向遗传学系统。通过将 pCMV 克隆到 pSP72-pT7-HδVrib-tT7 中制备质粒载体，产生载体 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV（飞哥。 1个).将流感病毒 A/PR/8/34 的第 5 段非编码区 (NCR) 两侧的 GFP 开放阅读框以反义方向克隆到 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV 中，带有 2 个额外的 G 残基。由于我们预计该质粒会导致 GFP 表达，而无需通过流感病毒聚合酶复合物进行小基因组复制（PCMV 相对于小基因组处于有义方向），我们还提供了一种类似的构建体来产生小基因组（0 G 残基）相对于 pT7 的有义方向（因此相对于 PCMV 为反义）。将微型基因组质粒与表达核 T7pol 和 pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA 和 pHMG-NP 的质粒一起转染到 293T 细胞中。 30 小时后通过 FACS 分析细胞（飞哥。 5个).

用不完整的流感病毒聚合酶复合物转染 sense-GFP 微型基因组 (S-0G) 会导致很少的 GFP 阳性细胞（飞哥。 5个，左图）具有非常低的 GFP 表达（飞哥。 5个，右面板）。在完整的流感病毒聚合酶复合物存在的情况下，约 7% 的细胞呈 GFP 阳性，平均荧光为 ~1200。使用反义 GFP 微型基因组质粒，相对较大比例的细胞 (~10%) 在没有完整的流感病毒聚合酶复合物的情况下表达 GFP，但仅在低水平（平均 GFP 荧光 182）。当共转染全长流感病毒聚合酶复合物时，表达GFP的细胞比例没有增加，而每个细胞的GFP表达水平显着增加（平均GFP荧光1205）。因此，从这个实验中我们可以得出结论，双向表达载体是有功能的；由于从 pCMV 产生 GFP mRNA，我们观察到不需要流感病毒聚合酶复合物的低水平 GFP 表达。值得注意的是，这通过单独使用 AS-2G-GFP 微型基因组质粒转染 293T 细胞得到证实，导致类似水平的 GFP 表达（约 19% 的细胞以 128 的平均荧光表达，数据未显示）。此外，由于从 pT7 转录的微型基因组复制，我们观察到在存在流感病毒聚合酶复合物的情况下 GFP 表达水平增加。因此，pT7-pCMV 双向表达质粒是有功能的。

使用基于双向 T7pol 的反向遗传学系统生产重组病毒

接下来，将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆到载体pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV中，用于产生重组流感病毒A/PR/8/34。我们用编码流感病毒 A/PR/8/34 和 pT7pol (pAR3132) 基因片段的八个构建体转染 293T 细胞。转染后，将胰蛋白酶添加到培养基中以允许产生的病毒复制。转染后 72 小时收集上清液并用于接种 MDCK 细胞。接种后 3 天，对这些 MDCK 细胞的上清液进行 HA 测定，作为病毒复制的指示。 HA测试为阴性，表明未回收到重组病毒。

从使用双向载体表达 PB2、PB1、PA 和 NP 基因的小型基因组报告基因测定中，我们获得了这些质粒的蛋白质表达非常低的证据（数据未显示）。我们假设 tT7 序列破坏了 pCMV 的转录，导致编码基因的低产量。因此，我们创建了一个新的双向质粒，从中去除了 tT7 序列 (pSP72-pT7-HδVrib-pCMV)。将流感病毒A/PR/8/34基因片段克隆到载体pSP72-pT7-HδVrib-pCMV中，得到重组流感病毒A/PR/8/34。同样，在最初的尝试中没有产生重组病毒。然而，在对用于转染的质粒数量进行一些优化后，我们成功地生产了重组病毒。用于该实验的质粒的量为编码 PB2、PB1、PA 和 HA 的每个构建体 10 µg，以及编码 NP、NA、MA 和 NS 的每个构建体 5 µg。虽然在 293T 细胞中无法检测到重组病毒滴度，但随后接种 MDCK 细胞会产生初始滴度为 1.3 × 10^5个TCID50/毫升。

MDCK 细胞中的 T7pol 系统

为了进一步证明基于 T7pol 的反向遗传学系统的普遍性，我们测试了 GFP 微型基因组在 MDCK 细胞而非 293T 细胞中的复制。尽管使用 BSR-T7 细胞进行的实验已经提供了 T7pol 反向遗传系统在非灵长类动物来源的细胞中起作用的证据（飞哥。 4个) MDCK 更常用于流感病毒研究和疫苗生产。

可以看出飞哥。 6个发现基于 T7pol 的反向遗传学系统在 MDCK 细胞中具有功能。结合BSR-T7细胞中的结果（飞哥。 4个) 这些实验表明，T7pol 反向遗传学系统确实是一个适用于多种细胞类型的“通用”系统。从该实验还可以得出结论，现在可以从非灵长类动物细胞生产重组流感病毒。

在这里，我们首次展示了在 293T 细胞中使用基于 T7pol 的系统生产重组甲型流感病毒 A/PR/8/34（MDCK 适应的 NIBSC 株）。但是，没有假设将这些方法的使用限制在甲型流感病毒 A/PR/8/34；它们可以应用于所有甲型、乙型和丙型流感病毒以及其他分段的负链 RNA 病毒。也没有假设将这些方法的使用限制在 293T 细胞、BSR-T7 细胞和 MDCK 细胞；例如，T7pol 可以通过转染范围广泛的细胞系来提供，然后可以在这些细胞系中生产重组病毒。

这种基于 T7pol 的反向遗传学技术的质粒载体及其包含的元件也具有很大的灵活性。在这里，我们使用噬菌体 T7 RNA 聚合酶来产生 vRNA 或 cRNA 样 RNA 分子，但也可以使用各种其他 RNA 聚合酶，例如噬菌体 SP6 RNA 聚合酶。在这里介绍的实验中，T7 RNA 聚合酶被修改为包含 SV40 大 T 抗原核定位信号，但 RNA 聚合酶可以使用各种其他核靶向信号（例如，hnRNP-K 蛋白的信号）进行本地化。我们在这里使用了丁型肝炎病毒核酶序列，但已经描述了可以替代使用的其他核酶序列。最后，此处描述的系统不依赖于使用基于小鼠羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶启动子（pHMG 结构）的流感病毒聚合酶蛋白表达载体；来自多种流感病毒的聚合酶蛋白可以使用多种表达载体进行表达。

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示例 2

重组病毒如上产生，基于具有相关流行病毒（例如 A/Moscow/10 /99）的 HA 和 NA 基因的高通量病毒主链（例如衍生自疫苗株 A/PR/8/34） . ).通过转染产生重组病毒后，病毒在适当的细胞底物（例如卵、MDCK 细胞、Vero 细胞）中被扩增到足够高的水平。当在含胚鸡蛋中繁殖时，通过离心 10 分钟澄清尿囊液。在 1000 x g 下并通过 0.45 微米过滤器过滤。现在通过在 4°C 下以 150,000 x g 离心 1.5 小时沉淀病毒并重悬于磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。然后用 2% 癸酰基-N-甲基葡糖酰胺 (MEGA) 处理病毒，覆盖在 PBS 中的 25% 蔗糖层上，并在 4°C 下以 250,000 x g 离心 1.5 小时。

然后用 PBS 透析含有 HA 和 NA 蛋白的上层，并使用用考马斯亮蓝染色的 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶确认蛋白质制剂的纯度和数量。雪貂用约 10 微克的 HA/NA 蛋白肌肉注射免疫。如有必要，可以进行后续多次剂量或佐剂（MF59，ISCOM）的疫苗接种。使用血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、ELISA、病毒中和试验等测定疫苗接种前后收集的血清样品中针对HA和NA的抗体滴度。接种疫苗和对照动物在接种疫苗后 6 周使用 1 x 10E5 50% 组织培养感染剂量 (TCID-50) 的流感病毒 A/Moscow/10/99 或异源病毒分离物进行攻击。攻击后，连续 10 天每天从动物身上采集鼻腔或咽喉拭子样本，并通过定量 PCR 分析或病毒滴定法确定受感染动物排出的病毒量。因此，获得的疫苗诱导免疫可以通过量化抗体滴度的增加和针对攻击病毒感染的保护水平来确认。